Из-за стесненного материального положения юноше пришлось бросить Пизанский университет и вернуться во Флоренцию. Дома Галилей самостоятельно занялся углубленным изучением математики и физики, которые его очень заинтересовали. В 1586 году он написал свою первую научную работу «Маленькие гидростатические весы», которая принесла ему некоторую известность и позволила познакомиться с несколькими учеными. По протекции одного из них — автора «Учебника механики» Гвидо Убальдо дель Монте, Галилей в 1589 году получил кафедру математики в Пизанском университете. В двадцать пять лет он стал профессором там, где учился, так и не завершив свое образование.
Галилей преподавал студентам математику и астрономию, которую рассказывал, естественно, по Птолемею. В работе «О движении» (1590 год) Галилей подверг критике аристотелевское учение о падении тел.
К этому же периоду относится установление Галилеем изохронности малых колебаний маятника — независимости периода его колебаний от амплитуды.
Критика Галилеем физических представлений Аристотеля восстановила против него многочисленных сторонников древнегреческого ученого. Молодому профессору стало очень неуютно в Пизе, и он принял приглашение занять кафедру математики в известном Падуанском университете.
Падуанский период, продолжавшийся 18 лет, был самым плодотворным и спокойным в жизни ученого. Здесь он обрел семью, связав свою судьбу с одинокой девушкой Мариной Гамба.
Галилей много работал, обдумывая будущие сочинения. Хотя с университетской кафедры он доносит до слушателей освященные церковью идеи перипатетиков о мироздании и даже доказывает «справедливость» геоцентризма, но одновременно он страстно ищет и находит новые подтверждения справедливости великого учения Коперника.
Узнав в конце 1608 года об изобретении за границей подзорной трубы, ученый увлеченно работает над собственной конструкцией, используя сочетание двояковыпуклой и двояковогнутой линз. Терпеливо создавая один за другим приборы со все большим увеличением, он, наконец, построил «прибор до такой степени превосходный, что при его помощи предметы казались почти в 1000 раз больше и более чем в 30 раз ближе, чем при наблюдении простым глазом», — вспоминает о своем изобретении в книге «Пробирщик» Галилей.
При помощи подзорной трубы ученым было обнаружено множество новых звезд, не видимых невооруженным взглядом, было доказано, что Млечный Путь состоит из большого скопления мельчайших звезд. Телескоп помог открыть на Луне существование гор и впадин, и, наконец, Галилей увидел на небе воочию прообраз системы Коперника — четырех спутников Юпитера, обращающихся вокруг него, как и Луна вокруг Земли. Знаменитое это открытие было сделано при помощи трубы с 30-кратным увеличением. Вот как Галилей рассказывает об этом открытии:
«7 января 1610 года, в первом часу ночи, наблюдая небесные светила, я, между прочим, направил на Юпитер мою трубу и, благодаря ее совершенству, увидел недалеко от планеты три маленьких блестящих звездочки, которых прежде не замечал вследствие слабого увеличения бывшей в то время у меня трубы. Эти светлые точки были приняты мною за неподвижные звезды, они обратили на себя мое внимание только потому, что все три находились на совершенно прямой линии, параллельной эклиптике, и были несколько ярче звезд одинаковой с ними величины. Расположение их относительно Юпитера быдо следующее: две находились на восточной стороне планеты, третья же на западной. Крайняя восточная звездочка и западная казались немного большими третьей. Я тогда не определял точным образом их взаимных расстояний, ибо, как сказано, они были сочтены мною за неподвижные звезды.
Через восемь дней ведомый не знаю какою судьбою, я опять направил трубу на Юпитер и увидел, что расположение звездочек значительно изменилось: именно все три помещались на западе от планеты и ближе одна к другой, чем в предшествовавшее наблюдение. Они по-прежнему стояли на прямой линии, но уже были разделены между собою равными промежутками. Хотя я был далек от мысли приписать это собственному движению звездочек, но тем не менее сомневался, чтобы такое изменение в их положении могло произойти от перемещения Юпитера, за несколько дней находившего на западе от двух звездочек. С величайшим нетерпением ожидал я следующей ночи, чтобы рассеять свои сомнения, но был обманут в своих ожиданиях, небо в эту ночь было со всех сторон покрыто облаками».